Тук ще проследя етапите от изолирането на стволови клетки от бластоцист. Експеримента започнах преди няколко дни и с течение на времето ще допълвам нови неща.
Каква е идеята накратко. Култивират се ин витро ембриони до фаза бластоцист в среда за стволови клетки съдържаща Lif (Leukemia inhibitory factor) и фибробласти . Ембрионите се прикрепват към слоя фибробласти, а средата промотира разрастването на вътрешната клетъчна маса (ICM - inner cell mass). След трипсинизиране, дисоциираните клетки се прехвърлят в ново петри със същата среда и образуват колонии от стволови клетки.

1. Подготовка за изолиране на преимплантационни ембриони.
Няма да се спирам в подробности на техниките за изолиране на преимплантационни ембриони, надявам се да имам време да го направя в отделен постинг, но в общи линии процедурата е следната. Кръстосвате мишки от избраната от вас линия. Три дни след това убивате хуманно женската и отпрепарирвате овариума, овидукта и утеруса. Промивате овидукта с M2 среда (на Sigma) и събирате ембрионите, които би трябвало да са във фаза морула (Е 2.5). Премествате ги с помощта на стъклена пипета в среда за култивиране (KSOM, FHM, M16, GM501 - culture) и CO2  инкубатор (10% CO2, 37 градуса С). Култивирате ги до фаза компактизирана морула или бластоцист.

2. Премахване на зона пелуцида.
Тази стъпка е опция. Има своите предимства и недостатъци.
а) Предимства. Ин витро култивирания бластоцист във фаза Е4.5 се освобожава сам от зона пелуцида, но това не правило, което се случва винаги. Ако не се освободи, ембриона умира и не се прикрепя към фибробластите. В нова статия побликувана в Cell, авторите твърдят, че премахването на зона увеличва извличането на стволови клетки до 80% .
б) Недостатъци. Премахването на зона пелуцида се осъществява чрез субстанция от соли с високо pH,  нар. Tyrode`s solution (Sigma), която може да увреди ембрионите, ако останат по-дълго в нея.

Премахване на зона чрез Tyrode`s solution. Необходимо ви в четири ямково петри. В една ямка слагате 100 - 150 микролитра среда GM501 Air и прехвърляте ембрионите там. В друга ямка отпипетирвате същия обем Tyrode`s solution. Другите две ямки ги пълните с М2 среда (или GM501 Air). Прехвърляте 3 - 4 ембриона в Tyrode`s solution, фокусирате на бинокуляра зона и ноблюдавате постоянно за промени. Първоначално периветелинното протстранство (между ембриона и зона) ще се разрастне, след това ще се случи обратния процес - зона ще се свие плътно до ембриона и накрая ще изчезне. В този момент преместете ембриона веднага в първата ямка с М2 среда и след това във втората за да промиете ембриона. След това преминете към стъпка 3.
Изчезването на зона в Tyrode`s solution може да е от 2-3 до 10 минути. Ако зона не изчезва използвайте нова капка с Tyrode`s solution. Внимавайте да не внесете много от средата с ембрионите, това променя pH на Tyrode`s solution и спира реакцията.

3. Трансфер на ембрионите в среда за култивиране на стволови клетки.
Необходими са ви 96 ямкови плаки покрити с фибробласти. Премахвате средата за култивиране на фибробласти и я заменяте с такава за култивиране на стволови клетки. Прехвърляте всеки ембрион в отделна ямка. Средата за стволови клетки е следната: 400 мл DMEM (Biochrom, Gibco), 75 ml 10% FCS (Gibco), oт 1000x stock: 5 ml Penicillin / Streptomici, 5ml L-Glutamine, 5ml Piruvate, 5ml Non essential amino acids; 3,5 μl β-mercaptoethanol, 1000 U Lif.

4. Разрастване на вътрешната клетъчна маса (ICM – inner cell mass).Три – четири дни след прикрепване не бластоциста към фибробластите, вътрешната клетъчна маса се разраства, а трофектодермата се диференцира в т.нар. гигантски клетки (Giants cells), които мигрират. На този етам трябва добре да трипсинизирате клетките и да ги прехърлите в нова ямка с фибробласти.

Individual steps of mESC derivation. (a) MEF feeder layer at low
(insufficient) and proper density. (b) Morphology of mouse E3.5 blastocyst
with inner cell mass (icm) indicated. (c–e) Blastocyst hatched on MEF feeder
2 d (c), 3 d (d) and 4 d (e) after extraction. (f) Examples of hatched
blastocysts with expanded ICM and defined ESC like population (arrows),
ready for the first trypsinization at day 5 or 6 after extraction. The blastocyst
shown gave rise to ESCs. (g) Morphology of mESC-like colony 2 d after the
first trypsinization. (h) Typical appearance of mESC colony at the stage when
it should be subjected to the second trypsinization (usually 4–5 d after the
first trypsinization). (i) Established mESC line. The pictures were taken with
an Olympus C7070 camera. Scale bars, 50 mm (a), 25 mm (b–i).